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鸡肺表面活性蛋白A（chickenpulmonarysur-factantproteinA,cSP-A）是Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一种亲水性糖蛋白，属于C型凝集素家族中的一种[1].C型凝集素的共同特征在于：氨基（N）末端含有胶原样结构域（collagen-likeregion,CLR）、羧基（C）端含有碳水化合物识别结构域，可与病原体和过敏原结合[2].cSP-A基因位于鸡6号染色体上，编码区全长669bp,含222个氨基酸残基（aa），分为5个结构域：N端区、CLR、未知区、茎区（neckdomain）和凝集素糖识别区（carbohydraterecogni-tiondomain,CRD）[3].近年来，对SP-A蛋白的免疫学功能的研究越来越深入，哺乳动物源SP-A已被证实可结合多种病原体，增强肺泡巨噬细胞的趋化作用和吞噬功能，诱导免疫细胞增殖，并刺激促炎细胞因子的产生[4].

虽然不同动物源的SP-A在功能上高度相似，但通过氨基酸序列比对却发现：cSP-A与哺乳动物源SP-A的同源性仅有40%左右[5],cSP-A在鸡体内的组织分布和临床作用是否与哺乳动物源的SP-A一致尚不得而知[1],而且，从鸡肺泡灌洗液获取天然cSP-A蛋白的步骤较为繁琐，费用昂贵，阻碍了cSP-A的临床研究和应用。

本实验室的前期工作已经对cSP-A的N末端和CRD分别进行了原核表达和多克隆抗体制备[6],但没有涉及cSP-A全长基因的研究。本研究将选择pCold-TF载体进行cSP-A全基因的载体构建，以期在大肠杆菌中实现高效可溶性表达，并对纯化产物进行生物学活性检测，为进一步研究cSP-A的功能和临床作用奠定基础。

1材料与方法

1.1实验动物与试剂

60日龄健康三黄鸡1只购自安徽省某鸡场。pMD19-TSimple、pCold-TF原核表达载体均购自宝生物工程（大连）有限公司。大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态、TRIzol试剂均购自美国In-vitrogen公司。反转录试剂盒购自普洛麦格生物技术有限公司。PhantaMaxSuper-FidelityDNA聚合酶购自南京诺唯赞生物公司。T4DNA连接酶、限制性内切酶NdeⅠ和SalⅠ均购自英国NEB公司。DL2000DNAladder、凝胶回收试剂盒均购自德国Qiagen公司。质粒小量提取纯化试剂盒购自美国Axygen公司。His·Tag融合蛋白纯化试剂盒购自德国Merck公司。10~250ku预染小分子质量蛋白质Marker购自美国热电公司。HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自美国Sigma公司。ECL显色发光试剂盒购自美国Piece公司。cSP-A的凝集素糖识别区多克隆抗体由本实验室制备[6].纯化的天然cSP-A蛋白由本实验室制备[6-7].

1.2RT-PCR

取健康鸡肺组织100mg,加入TRIzol试剂提取组织mRNA,-80℃保存备用。参照GenBank中cSP-A登录的全长序列（AF411083）设计了1对引物，上游引物：CCCAAGCAACCATGTTGTCT-TATT,下游引物：CTAATATTCACAGACTGT-GAGGCGG.利用Oligod（T）18引物对鸡肺组织mRNA进行反转录并获得其cDNA,然后进行PCR,扩增程序：95℃5min;94℃30s,60℃50s,72℃1min,共30个循环；72℃10min;维持在10℃。PCR产物进行电泳鉴定，回收目的条带，与pMD19-TSimple载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB平板，过夜培养，挑取阳性菌落进行PCR鉴定，并送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

1.3cSP-A成熟肽基因的PCR扩增

在获得cSP-A全长序列的基础之上，设计1对引物用于扩增cSP-A成熟肽全长，上游引物为cSPA-55F:ATTCATATGCCATGCACAGAAC（下划线处为NdeⅠ酶切位点），下游引物为cSPA-R:ATAGTCGACCTAATATTCACAG（下划线处为SalⅠ酶切位点）。PCR反应条件：94℃2min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,30个循环；72℃10min;10℃维持。PCR产物进行电泳鉴定，回收目的条带，-20℃储存备用。

1.4重组表达载体的构建

利用限制性内切酶NdeⅠ+SalⅠ分别对目的基因的PCR产物和pCold-TF表达载体质粒DNA进行双酶切，将纯化回收的PCR产物与相应酶切的表达载体连接，转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。PCR筛选阳性克隆，提取质粒DNA,送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

1.5重组蛋白的诱导表达、纯化

将pCold-TF与pCold-cSPA均转化到BL21（DE3）感受态细胞中，37℃培养过夜。取少量利用不同浓度的IPTG进行诱导表达，16℃诱导24h后收集菌液，超声波裂解，5000r/min离心10min,分别收取裂解上清和包涵体沉淀。利用His·Tag融合蛋白纯化试剂盒纯化。分别取上述少量蛋白质样品，加入等体积2×上样缓冲液，95℃加热处理5min,同时将pCold-TF空载体菌诱导产物作为阴性对照。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析融合蛋白的表达情况。

1.6免疫印迹

分别取0.1、0.5和1μg的cSP-A纯化产物，加入等量的2×上样缓冲液，95℃加热处理5min后，经SDS-PAGE分离，利用垂直转印仪，将胶上蛋白质转移至硝酸纤维素膜（NC）上，经考马斯亮蓝染色，将NC膜转移到50g/L脱脂奶粉溶液中4℃封闭过夜。弃封闭液，TBST洗涤后，加1∶1000稀释的cSPA-CRD小鼠多克隆抗体，室温下反应2h,TBST洗涤3~5次，二抗为1∶5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG,室温作用1h,TBST洗涤3~5次，用化学发光试剂盒（ECL）进行显色，在天能发光成像系统中成像分析。

1.7鸡肺灌洗液的制备及天然SP-A蛋白的制备与纯化

选取1.5kg左右的健康三黄鸡，按150mg/kg体质量注射戊巴比妥进行麻醉，对鸡颈部皮肤进行剥离，用手术刀做1cm纵切口，将连有医用三通阀的灌洗装置插入鸡气管内，一次性注入15mL灭菌PBS溶液，反复灌洗，收集洗液，经1000r/min离心10min,收集上清即为肺部灌洗液。采用Maltose-agarose亲和层析法[7]提取并纯化鸡肺灌洗液中的SP-A蛋白。

1.8抑菌活性检测

采用单层琼脂平板扩散法进行检测，以纯化的天然cSP-A蛋白作为对照。分别取巴氏杆菌、大肠杆菌（CMCC44102）、甲型副伤寒沙门菌（ATCC9150）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、粪肠球菌（CMCC29212）于LB培养基平板划线，37℃过夜培养。活化后的指示菌按1∶100滴加到40℃左右灭活的LB培养液中，振荡混匀，倒入灭菌的平板中，冷却凝固后，用内径7mm的打孔器分别在各指示菌平板上均匀打孔，依次加入1μg纯化的天然cSP-A蛋白、1μgpCold-cSPA原核表达纯化蛋白、1μgpCold-cSPA诱导表达产物、50μL无菌水（阴性对照）、50μL卡那霉素（100μg/mL）（阳性对照）。

2.1RT-PCR及克隆鉴定

通过RT-PCR成功地从鸡肺组织mRNA中扩增出预期大小的目的条带。将该PCR产物连接入pMD19-T载体中，阳性克隆被命名为pMDT-cSPA.测序结果发现，该基因为cSP-A,与GenBank中登录的序列（登录号：AF411083）的同源性为100%.为便于在大肠杆菌中表达，剪去其信号肽部分，以pMDT-cSPA质粒为模板，以cSPA-55F和cSPA-R为上、下游引物扩增出cSP-A成熟肽基因，双酶切PCR产物，再克隆入原核表达载体pCold-TF中。经PCR鉴定和测序，结果成功构建了表达cSP-A成熟肽基因片段的原核表达载体，遂将其命名为pCold-cSPA（见图1）。

2.2重组蛋白的表达和纯化

在16℃培养条件下，分别经终浓度为0.1、0.2、0.5和1mmol/LIPTG诱导pCold-cSPA24h,SDS-PAGE鉴定发现：用终浓度为1mmol/LIPTG诱导菌，pCold-cSPA的表达量相对较大，表达产物大小约为80ku（见图2A）。随后，利用1mmol/LIPTG大量诱导阳性克隆菌200mL,经超声波裂解后，融合蛋白主要以上清形式存在（见图2B）。取表达上清加入到平衡好的His·Tag树脂中，表达上清与树脂悬液的比例约为5∶1;最后分段收集洗脱液，取少量进行SDS-PAGE检测，结果成功获得纯化的cSP-A融合蛋白（见图3）。

2.3Western-blot分析

用抗cSPA-CRD小鼠多克隆抗体血清对纯化后的cSP-A蛋白进行Western-blot检测。结果显示，在80ku处出现单一的特异性条带（见图4），表明诱导表达的cSP-A重组蛋白能被抗其多克隆抗体特异性识别。

2.4抑菌活性检测

采用单层琼脂平板扩散法检测原核表达的cSP-A蛋白对各个指示菌的抑菌情况，结果（见图5）显示，阳性对照（即天然cSP-A蛋白和卡那霉素）对巴氏杆菌、大肠杆菌（CMCC44102）、甲型副伤寒沙门菌（ATCC9150）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、粪肠球菌（CMCC29212）均有一定的抑菌活性，但原核表达的cSP-A蛋白没有明显的抑菌活性。

3讨论

与哺乳动物源SP-A比较，发现cSP-A有下列4点不同。第一，CLR区不完整，仅包括一个胶原样G-X-Y三联体重复序列，有趣的是，同样定位于鸡6号染色体上的鸡肺凝集素（chickenlunglectin,cLL）在基因结构上无CLR区[8],但重组cLL蛋白能抑制人H3N2和H1N1亚型流感病毒的血凝活第11期黄琪等：鸡肺表面活性蛋白A的可溶性表达及活性检测性[9],提示CLR区完整性对其凝集活性的影响不大。第二，通过软件模拟cSP-A空间结构发现，尽管cSP-A的茎区较短，但其与猪、人源的SP-A的单体结构极其相似，似乎并不影响空间结构的形成。第三，多出了一个未知区，由54aa组成，这一区域的功能有待确定。第四，CRD区不仅有2个糖基化位点，2个钙离子结合位点，还有1个结合甘露糖的基序（215EPN217），这一基序可能会使CRD结合病原微生物糖蛋白的作用更为显着[10].基于这四点不同，有必要对cSP-A的全基因进行表达并进而获得大量可溶性cSP-A蛋白纯品，以研究其基因结构与生物学功能的关系，并期望将来用于临床研究。

原核表达系统是获取大量蛋白质的最直接途径，但是cSP-A全基因中有多个大肠杆菌的稀有密码子。为此，笔者曾尝试多种原核表达载体进行表达，但均未获得成功，只有在表达cSP-A基因的部分片段（例如N端区和C端CRD区），且突变了大肠杆菌的稀有密码子后才获得了高效表达，但表达产物均为包涵体，不宜进行生物活性的研究。为此，本研究选择pCold-TF原核表达载体，该表达载体带有冷休克蛋白A（cspA）启动子，融合触发因子（TF）、蛋白质水解位点和His标签分子，在低温环境中经IPTG诱导表达，不仅可增强目的蛋白的稳定性，而且有效促进融合蛋白的可溶性表达，便于蛋白质纯化，保证目的蛋白的天然活性[11].最终研究结果显示，cSP-A成熟肽在该载体中获得了高效可溶性表达；Western-blot结果显示，该蛋白质可被cSPA-CRD多克隆抗体特异性识别，表明cSP-A重组蛋白具有良好的反应原性（见图4）。

cSP-A与哺乳动物源SP-A序列的同源性不高，本研究通过抑菌试验证明：cSP-A蛋白原核表达产物无明显抑菌功能，而天然鸡肺灌洗液SP-A蛋白可高效抑制部分常见革兰阴性菌（巴氏杆菌、甲型副伤寒沙门菌、大肠杆菌）和革兰阳性菌（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌）（见图5）。这可能与原核表达产物没有天然蛋白的翻译后修饰，也不能形成三聚体，从而不能发挥天然蛋白的相似活性所致。下一步将通过cSP-A全长真核分泌性表达、杆状病毒载体真核表达系统等途径解决其生物学活性问题。

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