万界封神 第十一章 教授认同

“实验原理主要有:

慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。

2.主要材料:细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂

3.主要试剂配制

（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。

（2）细胞生长培养液：临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100ug/mL，置于4℃冰箱保存。

4.?实验步骤

（1）胰酶消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为0.5~1×105/ml（根据情况酌情调整），每孔200ul细胞悬液接种至24孔板，培养箱培养过夜。次日进行慢病毒感染，此时细胞的融合度约为70%左右。

（2）准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬时离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量，将其稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。

（3）根据预实验确认MOI=100进行后续试验，准确计算好每孔所需病毒原液量。慢病毒使用量=MOI*细胞数目/慢病毒滴度，吸取病毒液加入细胞中，同时加入5ug/mL的Polybrene助转染试剂，以提高感染效率。

注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前，细胞处于良好的生长状态。

（4）混匀后将24孔板放在37℃度培养箱中孵育。

（5）8-12小时以后观察细胞状态。细胞状态与未感染组无明显差异，表明慢病毒对细胞没有明显毒性作用，继续培养，24小时后更换为新鲜培养基。

（6）感染48小时后，荧光显微镜观察荧光表达情况，估计慢病毒感染目的细胞的效率。同时，收集样本进行后续实验检测。

Lentivirus表达时间较长，但在一般代谢较旺盛的细胞（如293T，BHK21等）上，病毒感染24h后可以观察到GFP荧光；代谢比较缓慢的细胞（如原代培养细胞，神经干细胞，胚胎干细胞等）GFP蛋白表达时间较长，感染后72-96h甚至更长时间才可以观察到GFP荧光。感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察GFP的表达时间和表达强度来确定Lentivirus对目的细胞的感染情况。感染后期请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液和传代，以保证细胞良好的生长状态。”

“主要就是这些，可能还有不完整的地方。教授你见谅……”

“不，你说的很好。我这里有一份试卷，你做一下吧我再仔细看看你的实力。”史迪威。

“好的教授。”接过史迪威递过来的卷子，杨欢做到一旁的讲台上认真的做了起来。

两个小时后，杨欢确认卷子上的题目都答完后。没有明显的过错后，她把卷子递给了史迪威。

结果卷子史迪威认真的看着杨欢写的答案，没多久他抬起头看着杨欢有点不敢相信。

“虽然你没有满分，但是也没差多少。这张卷子我能给你A，你以前学过是哪教授教你的。”

“我在家里自学过，没有哪位教授教我。只有贾维斯，辅导我的学习。”

“贾维斯？”

“贾维斯……”抬起左手，杨欢唤出贾维斯。

“小主人，有什么需要帮助的吗。”贾维斯的身影通过三维投射出来。

“这就是，贾维斯。”史迪威一开始贾维斯是哪个不知名的教授，没想到是人工智能。

“它就是贾维斯……”

“好吧，从你掌握的知识水平看。你可以直接拿毕业证书了……”史迪威教授说完，还不忘摊手表示一下。

“我是来进修博士的，贾维斯在这上面帮不了我教授。”

“好吧，我可以带你进行博士。不过我很严厉的，你也不要和他们两个学。”史迪威不忘贬低下玛丽和彼得。

玛丽和彼得发现，今天他们两人就想生活在梦里。

其实一开始玛丽带杨欢来找史迪威教授，她有点不相信杨欢是真的自己在家把学业学完了。来学校就是为了稍微学习小，然后考试拿证书的。

哪知道人家直接跳过研究生，直接来学习进修博士。

怎么人和人不一样呢，杨欢她才多大呀。难道世界上真的有妖孽……

她俩这次是真的怀疑人生了……